Espectrometría de masas
La espectrometría de masas conocida como matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), es una técnica que permite la identificación de microorganismos mediante el análisis de proteínas, principalmente ribosómicas, a través de la creación de un espectro de masas que es específico para cada especie. Un microorganismo dado presentará siempre una serie de picos característicos en el espectro, y esto permite la creación de bases de datos con los espectros de masas que presentan los distintos microorganismos. El espectro obtenido para un determinado microorganismo se compara automáticamente con la base de datos, y el resultado se emite junto a un puntaje o score. Ésta técnica, consta de cuatro pasos: la recuperación de una colonia aislada, la realización de un espectro de masas, la comparación con la base de datos y la entrega de resultados (Relloso et al., 2015).
La muestra obtenida de la colonia aislada del microorganismo en estudio que se aplica en la placa de metal pulido consta de metodologías diferentes: análisis de células intactas o transferencia directa, y extracción previa de proteínas. Para el análisis de células intactas, se selecciona la colonia de interés y se aplica directamente sobre la placa de metal pulido; mientras que para la extracción con etanol-ácido fórmico, se resuspende la colonia de interés con agua bidestilada y etanol, centrifugando y eliminando el etanol, para posteriormente añadir ácido fórmico al 70% y la misma cantidad de acetonitrilo para la disrupción de la pared celular. Una vez centrifugada la muestra, se recoge el sobrenadante y se aplica en la placa de metal pulido. A continuación, para cualquiera de las metodologías empleadas, se cubre la muestra con la solución matriz (generalmente una solución saturada de ácido alfaciano-4-hidroxicinamico, acetonitrilo y ácido trifluoroacético) la que se cristaliza al dejarse secar a temperatura ambiente. Esta matriz tiene dos funciones fundamentales; primero expone las proteínas intracelulares mediante la ruptura de la membrana celular y segundo, facilita la vaporización y la ionización de las proteínas mediante un haz de laser pulsante. Una vez ionizadas estas proteínas viajan por una cámara de vacío siendo detectadas al final. Dependiendo de la relación masa/carga de cada fragmento será el tiempo que ésta demore en llegar al final. Este "tiempo de vuelo" es utilizado para construir el espectro específico de las masas. La manera en que este espectro es analizado va a depender del software utilizado para realizar la identificación. Este espectro es comparado automáticamente con un archivo y el resultado es entregado automáticamente (García et. al., 2012, Jordana-Luch et al., 2012).
Una vez obtenido el espectro de masas y comparado con los existentes en la base de datos, el software le adjudica una identificación y un valor indicativo de la fiabilidad de dicha identificación. En el caso de Biotyper, se emplea una escala logarítmica que va de 0 a 3, y se recomienda dividir el rango en tres intervalos: un valor ≥2 indica una identificación fiable a nivel de especie, un valor entre 1.7 y 2 indica un parentesco muy cercano y ofrece una identificación fiable a nivel de género, y un valor <1,7 ofrece una identificación poco fiable (Jordana-Luch et al., 2012).
La muestra obtenida de la colonia aislada del microorganismo en estudio que se aplica en la placa de metal pulido consta de metodologías diferentes: análisis de células intactas o transferencia directa, y extracción previa de proteínas. Para el análisis de células intactas, se selecciona la colonia de interés y se aplica directamente sobre la placa de metal pulido; mientras que para la extracción con etanol-ácido fórmico, se resuspende la colonia de interés con agua bidestilada y etanol, centrifugando y eliminando el etanol, para posteriormente añadir ácido fórmico al 70% y la misma cantidad de acetonitrilo para la disrupción de la pared celular. Una vez centrifugada la muestra, se recoge el sobrenadante y se aplica en la placa de metal pulido. A continuación, para cualquiera de las metodologías empleadas, se cubre la muestra con la solución matriz (generalmente una solución saturada de ácido alfaciano-4-hidroxicinamico, acetonitrilo y ácido trifluoroacético) la que se cristaliza al dejarse secar a temperatura ambiente. Esta matriz tiene dos funciones fundamentales; primero expone las proteínas intracelulares mediante la ruptura de la membrana celular y segundo, facilita la vaporización y la ionización de las proteínas mediante un haz de laser pulsante. Una vez ionizadas estas proteínas viajan por una cámara de vacío siendo detectadas al final. Dependiendo de la relación masa/carga de cada fragmento será el tiempo que ésta demore en llegar al final. Este "tiempo de vuelo" es utilizado para construir el espectro específico de las masas. La manera en que este espectro es analizado va a depender del software utilizado para realizar la identificación. Este espectro es comparado automáticamente con un archivo y el resultado es entregado automáticamente (García et. al., 2012, Jordana-Luch et al., 2012).
Una vez obtenido el espectro de masas y comparado con los existentes en la base de datos, el software le adjudica una identificación y un valor indicativo de la fiabilidad de dicha identificación. En el caso de Biotyper, se emplea una escala logarítmica que va de 0 a 3, y se recomienda dividir el rango en tres intervalos: un valor ≥2 indica una identificación fiable a nivel de especie, un valor entre 1.7 y 2 indica un parentesco muy cercano y ofrece una identificación fiable a nivel de género, y un valor <1,7 ofrece una identificación poco fiable (Jordana-Luch et al., 2012).
